====== 染色(酸性フクシン) ======


<WRAP center round todo 60%>
開発中。
</WRAP>

白い検体(処理すると透明になる)の場合に染色を行う。
[[:acid fuchsin]]による染色はアブラムシ、カイガラムシ、コナジラミ等を
[[:canada balsam]]で封入する場合の代表的な方法。
文献に載っている方法ではどうもうまく行かないので、
私が行っている方法を紹介する。
簡単に言うと、
極めて薄い染色液で加温し長時間掛けて処理する。
そのため容器は漏れの少ない[[:microtube]]を使用する。

<WRAP hide>
-> 
これは[[:staining]]に書くべきか。
斑紋が重要な場合、
位相差顕微鏡で観察する場合はやらなくても良いと書かれている文献もある[(schauff2001>>page:41)]。
基本透明で一部に斑紋がある場合はどうして良いのかわからないがとりあえず少しやることにするかな? 
</WRAP>


===== 用具 =====

  * 2mL程度の[[:pp]]製の半透明な[[:microtube]]、底は丸か浅いV字型の方が良い。
  * [[:acetic acid]]
  * [[:acid fuchsin]] 0.001% 染色液。
  * 細口[[:pipette]]
  * 太口[[:pipette]]
  * [[:hot plate]]。加温する場合に必要。なくてもできるかもしれないがすごく時間が掛かる。
  * [[:microtube holder]]
  * 鶏卵の卵殻膜(薄皮)。濃くなりすぎた時に脱色するのに使う。

卵殻膜はゆで卵を作ったときに取り出して､お酢などに浸けて卵殻の成分(炭酸カルシウム)を溶かし､水洗後乾燥させたものを小さく切ってケースに入れておく。長期保存できる。


===== 手順 =====

前工程は[[:acidification]]か[[:defatting]]で、
浅い容器に入っているとする。

まとめて処理し個別に掬うことはしないので、
複数個体をまとめて処理する場合は同種の同じような大きさものをまとめること。

(1) 前工程で使用した薬液を細口[[:pipette]]を使って排液し

(2) [[:acetic acid]]を0.2〜0.5mLくらい加える。

<WRAP tdl right 40%>{{:bottles:microtube_holder-06.png?400x300|}}</WRAP>
(3) 太口ピペットを使い検体を[[:acetic acid]]ごとマイクロチューブに移動し、
チューブの外から観察できるように氷酢酸の量を調節する。
<WRAP clear/>

(4) 0.001%染色液を検体の数の1/2から同程度の滴数(検体が6個の場合3〜6滴)加えフタをしっかり絞める。
1滴の量...

(5) マイクロチューブをホルダーに固定し[[:hot plate]]に入れて60℃設定で8時間ほど静置する。
ときどき観察する。
観察する場合はチューブを振って液滴を除いて中が見えるようにし､斜めに保持してチューブ越しに[[:stereo microscope]]で観察する。

【薄い場合】
8時間ぐらいおいても薄い場合は、0.001%[[:acid fuchsin]]を追加して様子を見る。

【斑になった場合】 
途中で斑になることも多く､その場合は平均すると良い染まり具合になりそうと思った時点で､
薬液を[[:acetic acid]]に置き換え、そのまま加温を続ける。
8時間ぐらい置く。

【濃くなりすぎてしまった場合】
途中で濃くなり過ぎたと思ったら､
薬液をただの[[:acetic acid]]に置き換え､
卵殻膜を投入し加温して静置する。

(7) 【ええ感じにそまったら】終了。


===== 注意点 =====

  * [[:acid fuchsin]]は可燃性なので扱いには注意すること。
  * フタを開けるときは少し冷ましてからの方が良い。
  * 次の[[:clearing]]に時間を掛けないこと。5分程度行った後､すぐにマウントする。 -> クローブオイルの品質の問題もあるか?


===== 備考 =====

なにかバッファ的なものを入れて染色液の量を一定にさせることができないか?
決まった大きさの卵の薄皮などを一緒に入れるなどして。

容器はガラス製の短い[[:test tube]]の方が良い気がするけど、わざわざ入手する必要もないか。

小さい刺毛がとても見づらいのでこれだけを染める[[:finishing staining]]について開発中。



<WRAP hide>

  



一般的に行なわれている方法とは少し違うが、私は以下のように処理している。
文献に載っている方法だとどうもうまく行かない。
-> アルカリがなかなか落ちないのかもしれない。
コナジラミが種類によって染まりにくいということかもしれない。

[[:dewaxing]]と[[:acidification]]後に行う。
[[:acidification]]を完全に行うために、
ごく少量の[[:acid fuchsin]]を入れておくと判断しやすいかもしれない。
-> これは独立に行う。


**染色開始**



同じような大きさの検体をまとめて処理する。

[[:decantation]]し、[[:acetic acid]]を 0.5〜1mLぐらい加える。
何かですすぐ必要はない。


0.001%[[:acid fuchsin]]染色液を1〜数滴加える。
検体の大きさや個数による。
個体の数だけの

フタをする。
加温しながら様子を見る(〜1時間?)。

<wrap em>氷酢酸は可燃性なので火気、静電気等に注意すること。
また刺激臭がかなり強い。</wrap>

斑に染まってくるが全体を平均すれば良いかなという状態で終了する。


**均し**

[[:decantation]]し、新しい[[:acetic acid]]に入れ替える。
加温しながら8時間ぐらい放置すると斑が消えて平均的に染まる(**均し**)。
均しは時間が掛かる。


脱色は少し時間が掛かるので、
染色を早めに切り上げて均しに移行し、
薄かったら再度染色というのを繰り返すと良いかもしれない。

常温でもできると思うが時間は調べないとわからない。
すごい時間掛かりそう。

どれぐらいの濃度で仕上げるか。
濃いとすごく見にくいので、薄めが良いと思う。
写真!!


===== 脱色方法 =====

濃くなりすぎた場合、
氷酢酸中に検体と一緒にシリカゲルを数粒入れて色素を吸着させるという方法を試している。
実験中。

</WRAP>

===== 参考文献 =====
~~REFNOTES~~

<wrap small>
[[:refnotes:schauff2001]]
</wrap>

===== Backlinks =====
{{backlinks>.}}

<WRAP hide><nowiki>
===== TODO =====
</nowiki></WRAP>