====== 染色(酸性フクシン) ======


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開発中。

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白い検体(処理すると透明になる)の場合に染色を行う。
[[:acid fuchsin]]による染色はアブラムシ、カイガラムシ、コナジラミ等を
[[:canada balsam]]で封入する場合の代表的な方法。

文献に載っている方法とは若干違うが､私が行っている方法を紹介する。
簡単に言うと、
溶媒は[[:gaa]]で、染色液は極めて薄いものを使い(0.001%)、
加温して長時間(8時間以上)掛けて処理する。
そのため容器は漏れの少ない[[:soaking tube]]を使用する。

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-> 
これは[[:staining]]に書くべきか。
斑紋が重要な場合、
位相差顕微鏡で観察する場合はやらなくても良いと書かれている文献もある[(schauff2001>>page:41)]。
基本透明で一部に斑紋がある場合はどうして良いのかわからないがとりあえず少しやることにするかな? 
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===== 用具 =====

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道具一式の集合写真
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  * 1.5〜5mLくらいの[[:soaking tube]]
  * [[:gaa]]
  * [[:acid fuchsin]] 0.01と0.001% 染色液。数が多い場合は0.01%を使う。
  * 細口[[:pipette]]
  * [[:hot plate]]
  * [[:microtube holder]] ホットプレートに収められる小型のもの。
  * 吸着剤(下記)。濃くなりすぎた時に脱色するのに使う。
  * [[:tweezers]] 吸着剤を扱うときに使う
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<WRAP tdl right 40%>{{:staining:staining-02.jpg?400x300|}}
濃くなり過ぎたときに使う吸着剤。鶏卵の卵殻膜を小さく切ったもの。　
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吸着剤は鶏卵の卵殻膜をあらかじめ以下のように調整しておく。
  - ゆで卵を作ったときに、卵殻膜(薄皮)を取り出す。
  - 取り出した卵殻膜を10%ぐらいの[[:acetic acid]]に1日ぐらい浸けて卵殻の成分(炭酸カルシウム)を溶かす。
  - 水洗、乾燥する
  - 小さく切ってケースに入れておく。長期間保存できる。
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===== 手順 =====

前工程は[[:dewaxing]]で[[:soaking tube]]に入っているとする。

複数個体まとめて処理する場合は同種の大きさの揃ったものをまとめること
(個別に掬うことはしないので)。

(1) 前工程で使用した脱ロウ剤を細口[[:pipette]]を使って慎重に[[:decantation]]する(検体を吸い込んだり潰したりしないように)。

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(2) 次に(すすぐ必要はない)、[[:gaa]]を0.2〜0.5mLくらい加える。
[[:gaa]]の量はそれほど多くなくて良い。
多いとチューブ越しに[[:stereo microscope]]で観察しづらくなる。

さらに、[[:acid fuchsin]]染色液を加えフタをしっかり閉める。
染色液の量は0.001%のものを検体の数の1/2から同程度の滴数(検体が6個の場合3〜6滴)とする。
検体の数が多い場合は0.01%を使う。
かなり薄いように見えるがこれで良い。
1滴の量!!

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<WRAP tdl right 40%>{{:preparation:dewaxing-3.jpg?400x300|}}</WRAP>
(3) マイクロチューブをホルダーに固定し[[:hot plate]]に入れて60℃設定で8時間ほど静置する。
ときどき観察する。
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<WRAP tdl right 40%>{{:bottles:microtube_holder-06.png?400x300|}}</WRAP>
[[:stereo microscope]]で状態を見る場合は図のように、
マイクロチューブを斜めに保持して水平な液面の下に検体が来るようにするといくらか見やすい
(液体の量が多いとこれができない)。
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<WRAP tdl right 40%>{{:no image.webp?400x300|}}</WRAP>
【薄い場合】
8時間ぐらいおいても薄い場合は、0.001%[[:acid fuchsin]]を追加して様子を見る。
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<WRAP tdl right 40%>{{:no image.webp?400x300|}}</WRAP>
【斑になった場合】 
途中で斑になることも多く､その場合は平均すると良い染まり具合になりそうと思った時点で､
薬液を[[:gaa]]に置き換え、そのまま加温を続ける。
8時間ぐらい置く。
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<WRAP tdl right 40%>{{:staining:staining-05.jpg?400x300|}}
濃すぎる。
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【濃くなりすぎてしまった場合】
途中で濃くなり過ぎたと思ったら､
薬液をただの[[:gaa]]に置き換え､
吸着剤(卵殻膜)を何枚か投入し加温して静置する。
かなり時間が掛かるが色素が吸着剤に移る。
濃すぎると[[:biological microscope]]で観察したときにコントラストが低くく見づらい。
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<WRAP tdl right 40%>{{:staining:staining-07.jpg?400x300|}}
これぐらい。
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【ええ感じにそまったら】終了。
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===== 注意点 =====

  * [[:gaa]]は可燃性なので扱いには注意すること。
  * フタを開けるときは少し冷ましてからの方が良い。
  * 次の[[:clearing]]に時間を掛けないこと。5分程度行った後､すぐにマウントする。 -> クローブオイルの品質の問題もあるか?



===== 課題 =====

  * 脱ロウと同時にできない?
  * なにかバッファ的なものを入れて染色液の量を一定にさせることができないか? 決まった大きさの卵殻膜を一緒に入れて一定量の染色液を使うとか。
  * 容器はガラス製の短い[[:test tube]]の方が良い気がするけど、わざわざ入手する必要もないか。
  * 小さい刺毛がとても見づらいのでこれだけを染める[[:finishing staining]]というのは可能だろうか。

===== 関連事項 =====

  * [[staining:study]]

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===== 参考文献 =====
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~~REFNOTES~~

===== Backlinks =====
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===== TODO =====
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