SpecimenWiki

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====== 染色に関する調査 ======

<WRAP center round todo 60%>
工事中
</WRAP>

酸性フクシン


===== 文献からの情報 =====

**コナジラミ**

> <wrap :en>
Pale puparia may be stained.
Add several drops of glacial acetic acid and a few drops of acid fuchsin stain.
Agitate the watch glass so the stain is uniformly mixed.
Once the puparia have become a pale pink colour, decant the staining solution.
Add fresh glacial acetic acid to the specimens and leave for at least 5 min to dehydrate completely.
This is again pipetted off.
[(eppo2004>>page:288)]
</wrap>

**カイガラムシ**

> <WRAP :en>
5. Rinse and staining. Transfer to distilled water in a
staining well for about 5–10 minutes; then follow one of
staining methods below:
Fuchsin stain: add 1–2 drops of acid fuchsin stain
(see below for recipe), leave for about 30 minutes or longer
until the specimens are a good bright pink colour, then
continue to step 6.

Solutions
1. Acid Fuchsin Stain
To make stain from the powder: add 0.35 g acid fuchsin
and 25 ml glacial acetic acid to 75 ml distilled water.
[(henderson2011>>pages:17-18)]
</WRAP>

**カイガラムシ**

> <WRAP :en>
4. Staining \\
The clean specimens are stained in a mixture of acid Fuchsin stain and Essig’s aphid fluid for 12-
24 hours; this mixture has the advantage that it will not dry up, so it can be heated at 60 °C for half
an hour to several hours to speed up the staining process. The staining mixture can be reused many
times. Alternatively, specimens may be stained more quickly in acidified 80% alcohol (but this 
evaporates rapidly and there is a risk of damaging the specimens if they dry out). If specimens do
not stain well (due to residual traces of KOH), a few drops of glacial acetic acid added to the dish
usually darkens the stain. See Table 2 for the preparation of liquids used in the staining process.

Table 2. Common reagents used for staining scale insect cuticle
^Reagent  ^Contents^
|Essig's aphid fluid|20 parts lactic acid (reagent grade 85%) + 2 parts phenol (liquefied) + 4 parts glacial (100%) acetic acid + 1 part distilled water. Heat at 56-60°C for 30-60 minutes. Label and store solution in a dark bottle.|
|Acid alcohol|20 parts glacial acetic acid + 80 parts 50% ethanol|
|Acid Fuchsin|Acid Fuchsin powder (0.5 g) + 10% HCl (25 ml) + H<sub>2</sub>O (300 ml)|
|Acid Fuchsin stain|3 parts acid alcohol + 1 part acid Fuchsin. |

〜 [(kondo2022)]
</WRAP>


**腹吻亜目**

> <WRAP :en>
**Staining**:
Temporary slides were mounted in a water-soluble mountant, so staining with
water soluble Acid Fuchsin was not possible. For permanent mounts, all Sternorrhyncha with
membranous, colourless cuticle (except aphids and psyllids, in which pigmentation patterns
are taxonomically useful) were stained in a mixture of Acid Fuchsin stain and Essig’s Aphid
Fluid for 12-24 h. It is possible to stain in acidified 80% alcohol, but this evaporates quickly;
Essig’s Aphid Fluid was used instead, as it does not evaporate quickly and can be heated
safely. If specimens refused to take colour (due to presence of traces of KOH), a few drops 
Sirisena et al.
142
of glacial acetic acid were added to the dish. Staining could be accelerated by several hours
by warming at 60 °C. 
[(sirisena2013>>page:141)]
</WRAP>

** カイガラムシ **

> <WRAP :en>
**6 氷酢酸浸漬（除水，染色調整）** \\
70％酢酸で洗浄して虫体が十分に透明になったら，染
色液を 1 ～数滴滴下した 100％酢酸を入れたシャーレに
虫を移し換え，1 時間から数時間静置して染色調整と除
水を行う。この処理では薬液を一回以上交換したほうが
よい。
[(tanaka2014>>page:50)]
</WRAP>


===== 試してみてわかったこと =====

[[:acid fuchsin]]による染色。
コナジラミが染まりにくいのか、
なかなかうまく行かない。

==== 溶媒 ====

[[:acetic acid]]、70%[[:ethanol]]、70%[[:acetic acid]](->これ氷酢酸と分ける!!)のどれでも大丈夫そうだが、
[[:acetic acid]]が酸性化されるし脱水もされるので効率的に良いと思う。

[[:hcl]]を含む[[:acid alcohol]]でを使うと染まらないどころか脱色される。


==== 方法 ====


<WRAP center round todo 60%>

いままで染まりにくかったのは
薄すぎるのか、あるいはアルカリが抜けていないのだろうか。
やり直し!!

氷酢酸に十分浸けた後と浸けずに
  * 氷酢酸　

方法

  - 酸性化。氷酢酸。別工程だがごく薄く染めると良いかも。酸性化完了の判断になる。酸アルコールだと薄く染めるのができない。
  - 染色。氷酢酸0.5mL、0.1%フクシン染色液1滴。
  - 均し。氷酢酸。

</WRAP>


前の処理が[[:dewaxing]]の場合、[[:decantation]]して以下の作業に移れば良い(すすぐ必要なし)。

検体の入った容器に[[:acetic acid]]を0.5mL〜1mL程度加え、
0.01%[[:acid fuchsin]]染色液を1〜数滴落とす。
60℃に加温して数時間置く。
斑に染まってくるので適当なタイミングで[[:acetic acid]]に入れ替え、
60℃に加温して半日〜1日ぐらい置く(**均し**)。

温度と時間は、検体の種類や状態、大きさや数等により、かなりばらつきがあると思う。

濃く染まった場合[[hcl]]が無い場合は脱色するのに時間が掛かるので、
少しずつ染める方法が良いかもしれない(薄く染めて均しを行うことを繰り返す)。

==== 染色液の濃度 ====

実験中。

かなり薄くても染まる。

例えば、0.5mL程度の[[:acetic acid]]に対して0.01%の[[:acid fuchsin]]染色液を1〜数滴で良さそう。
薄いときのメリットは溶媒はほぼ透明で検体だけが色づくので染まり具合が分かりやすいこと。
時間が掛かりそうだがどのみちムラを取るのに時間が掛かるのでたぶんトータルでは大差ない。

==== 容器 ====

加温する場合はスクリューキャップのできれば小さめの容器が良い。


==== 濃度 ====

どれぐらいの濃さに仕上げるか。
濃いと見づらいのである程度薄い方が良い。

写真!!


==== 均し ====

実験中。

たいてい不均一に染まるので、平均化のために均し処理を行う。
[[:acetic acid]]に浸けて加温して半日〜1日置く。
[[:acidification]]を省略した場合同時に行える。
また[[:dehydration]]も同時に行える。

==== 脱色 ====

  * アルカリに浸けてリセットする。酸性化をやり直す必要があるのでこれは除外するか。
  * [[:acid alcohol]]に浸ける方法。なぜか短時間で脱色できる。
  * 70%[[:ethanol]]等に吸着剤と共に入れる方法。加温してもかなり時間が掛かる。
  * 卵の殻を使う方法。

=== 酸アルコールによる脱色方法 ===

どういう理屈かまったくわからないのだけど、
[[:acid alcohol]]にに浸けると急速に脱色される(常温でも数分?)。
酸アルコールの組成は10%[[:hcl]]:1容、70%[[:ethanol]]:9容。

そのままだと早すぎて止めようとしたら手遅れになるのでもう少し薄める。
氷酢酸中に1滴垂らす感じ?

=== 70%エタノールと吸着剤による脱色方法 ===

実験中。

70%[[:ethanol]]中に吸着剤とともに入れておくと脱色されるが加温してもすごい時間が掛かる。
[[:acid fuchsin]]用の吸着剤としていくつか試してみたが以下のものが使えるかもしれない。

  * 卵殻膜(ゆで卵の薄皮) 小さく切って乾燥したものは保存しておける。
  * シリカゲル
  * 洗濯で使う色移り防止シート

=== 卵の殻を使った脱色方法 ===

実験中。

[[:acetic acid]]中に卵の殻と共に検体を入れ加温する。
卵の殻の主成分である炭酸カルシウムと酢酸が反応して中和するのかと思いきや氷酢酸だと反応しないようだ。
水を追加すると泡が出て溶ける。なぜか?
溶けてないということは変なものは生成されないんじゃないかと思うけど。
上の吸着剤と似ているがそれよりも早い気がする。



==== 大きさがかなり違う検体を混ぜない ====

想像だが、
色素が均等に分散されるとすると外皮の厚い部分は色が濃くなり薄い部分は薄くなるはず。
そうすると外皮の厚さがかなり違うようなものを同じ容器で処理しない方が良い気がする。
例えば齢数の異なる検体を混ぜて処理しない方が良いと思う。
まぁやらないと思うけど。

==== 仕上げ染 ====

コナジラミの場合、刺毛が小さくて生物顕微鏡で普通に観察するととても見づらい。
刺毛は染まりやすいと思うので最後の均し後に軽く染めることで刺毛だけ染められると良いかも?
管状孔のところも染まりやすい。
これは別のところで。


==== クローブオイルに長時間浸けない ====

この後の[[:clearing]]処理でクローブオイルに浸けるが長時間浸けると脱色される。
もし処理を中断したい場合は、染色後[[:acetic acid]]に浸けた状態で保存する。


==== 課題 ====

このやりかただと染まりにくい部分も染まってしまいコントラストが低くなってしまう気がす。
といって、どうすればよいのか。



===== 参考文献 =====
~~REFNOTES~~

<wrap small>
[[:refnotes:eppo2004]],
[[:refnotes:henderson2011]],
[[:refnotes:kondo2022]],
[[:refnotes:sirisena2013]],
[[:refnotes:tanaka2014]]
</wrap>

===== Backlinks =====
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===== TODO =====
</nowiki></WRAP>