染色に関する調査

酸性フクシン

コナジラミ

Pale puparia may be stained. Add several drops of glacial acetic acid and a few drops of acid fuchsin stain. Agitate the watch glass so the stain is uniformly mixed. Once the puparia have become a pale pink colour, decant the staining solution. Add fresh glacial acetic acid to the specimens and leave for at least 5 min to dehydrate completely. This is again pipetted off. (eppo2004)

カイガラムシ

5. Rinse and staining. Transfer to distilled water in a staining well for about 5–10 minutes; then follow one of staining methods below: Fuchsin stain: add 1–2 drops of acid fuchsin stain (see below for recipe), leave for about 30 minutes or longer until the specimens are a good bright pink colour, then continue to step 6. (Rosa C. Henderson, 2011, p.17)

カイガラムシ

4. Staining
The clean specimens are stained in a mixture of acid Fuchsin stain and Essig’s aphid fluid for 12- 24 hours; this mixture has the advantage that it will not dry up, so it can be heated at 60 °C for half an hour to several hours to speed up the staining process. The staining mixture can be reused many times. Alternatively, specimens may be stained more quickly in acidified 80% alcohol (but this evaporates rapidly and there is a risk of damaging the specimens if they dry out). If specimens do not stain well (due to residual traces of KOH), a few drops of glacial acetic acid added to the dish usually darkens the stain. See Table 2 for the preparation of liquids used in the staining process.

Table 2. Common reagents used for staining scale insect cuticle

Reagent	Contents
Essig's aphid fluid	20 parts lactic acid (reagent grade 85%) + 2 parts phenol (liquefied) + 4 parts glacial (100%) acetic acid + 1 part distilled water. Heat at 56-60°C for 30-60 minutes. Label and store solution in a dark bottle.
Acid alcohol	20 parts glacial acetic acid + 80 parts 50% ethanol
Acid Fuchsin	Acid Fuchsin powder (0.5 g) + 10% HCI (25 ml) + H20 (300 ml)
Acid Fuchsin stain	3 parts acid alcohol + 1 part acid Fuchsin.

〜 (Takumasa Kondo, Gillian W. Watson, 2022)

腹吻亜目

Staining: Temporary slides were mounted in a water-soluble mountant, so staining with water soluble Acid Fuchsin was not possible. For permanent mounts, all Sternorrhyncha with membranous, colourless cuticle (except aphids and psyllids, in which pigmentation patterns are taxonomically useful) were stained in a mixture of Acid Fuchsin stain and Essig’s Aphid Fluid for 12-24 h. It is possible to stain in acidified 80% alcohol, but this evaporates quickly; Essig’s Aphid Fluid was used instead, as it does not evaporate quickly and can be heated safely. If specimens refused to take colour (due to presence of traces of KOH), a few drops Sirisena et al. 142 of glacial acetic acid were added to the dish. Staining could be accelerated by several hours by warming at 60 °C. (UGAI Sirisena, et al., 2013, p.141)

カイガラムシ

6 氷酢酸浸漬（除水，染色調整）
70％酢酸で洗浄して虫体が十分に透明になったら，染 色液を 1 ～数滴滴下した 100％酢酸を入れたシャーレに 虫を移し換え，1 時間から数時間静置して染色調整と除 水を行う。この処理では薬液を一回以上交換したほうが よい。 (田中 宏卓, 2014, p.50)

酸性フクシンによる染色

氷酢酸で特に問題なさそう。 酸性化されるし、脱水もされるので効率的にも良いと思う。

塩酸を含む酸アルコールでを使うと染まらないし、むしろ脱色される。 酸性化工程で使うと染まらなくなる。 ので塩酸は全工程で使わないことにする。

かなり薄くても染まる。 例えば、0.5mL程度の氷酢酸に0.01%の酸性フクシン染色液を1滴加えただけの溶液でも染まる。 薄いときのメリットは、 溶媒はほぼ透明で検体だけが色づくので染まり具合が明確にわかることである。 時間が掛かりそうだが、どのみちムラを取るのに時間が掛かるので大差ない。 ということで、透明に近くなるほど薄めるという意味で、0.01%が良さそうに思っている。

前の処理が脱脂・脱ロウの場合、️排液して以下の作業に移れば良い(すすぐ必要なし)。

検体の入った容器に氷酢酸を0.5mL〜1mL程度加え、0.01%酸性フクシン染色液を1滴落とす。 60℃に加温して数時間置く。 斑に染まってくるので適当なタイミングで氷酢酸に入れ替え、 60℃に加温して半日〜1日置く(均し)。

温度と時間は、検体の種類や状態、大きさや数等により、かなりばらつきがあると思う。

濃く染まった場合、後述する方法で脱色できるが時間が掛かるので、 染色は早めに切り上げて、均しに移行し、 様子を見ながらまた染色液に戻すということを繰り返す方法を取った方が良いかもしれない。

加温する場合はスクリューキャップのできれば小さめの容器が良い。

どれぐらいの濃さに仕上げるか。 濃いと見づらいのである程度薄い方が良い。

写真!!

70%エタノールに浸けておくと脱色できるように書かれた文献も見られるがうまく行かない(引用!!)。

アルカリにつけるのはだめなのか?

酸アルコールに浸けるとなぜか脱色される。

吸着剤とともに氷酢酸中に浸けておく方法。 ただし、温度と時間は検体の種類などにより大きく変わると思われるが、加温してもかなり長時間要するかもしれない。 → すごい時間が掛かる。

酸性フクシン用の吸着剤としていくつか試してみたが、 扱いやすいものとしては

• シリカゲル → 一応使えそう。→ すごい時間が掛かる。粒をピンセットで(→スパーテル)拾って入れれば良いので扱いが簡単。反応で変な物質が精製されなさそう(わからんけど)。

テストしてみたいもの

• 洗濯で使う色移り防止シート

その他ダメっぽいもの。

• 絹糸 → 吸着するが糸は扱いが面倒。
• 紙 → 炭酸カルシウムの入っていない、ろ紙を使ってみたが吸着しないっぽい。
• 卵の殻 → 良く吸着するが、アルカリが精製されるので良くないかも。
• 卵の薄皮 → 最初使えたと思ったがしばらくしてやってみたら使えなかった。乾燥するとダメなのかも。面倒だしいいや。→ そうじゃなくて今テストしてる検体が染まりにくいっぽい。
• 米粒 → 良く吸着するが何が精製されるかわからんしやめておこう。

想像だが、 色素が均等に分散されるとすると外皮の厚い部分は色が濃くなり薄い部分は薄くなるはず。 そうすると外皮の厚さがかなり違うようなものを同じ容器で処理しない方が良い気がする。 例えば齢数の異なる検体を混ぜて処理しない方が良いと思う。 まぁやらないと思うけど。

コナジラミの場合、刺毛が小さくて生物顕微鏡で普通に観察するととても見づらい。 刺毛は染まりやすいと思うので最後の均し後に軽く染めることで刺毛だけ染められると良いかも? 管状孔のところも染まりやすい。 これは別のところで。

この後の透明化処理でクローブオイルに浸けるが長時間浸けると脱色される。 もし処理を中断したい場合は、染色後氷酢酸に浸けた状態で保存する。

このやりかただと染まりにくい部分も染まってしまいコントラストが低くなってしまう。 といって、どうすればよいのか。

EPPO (2004) Bemisia Tabaci, Henderson, R. C. (2011) Diaspididae (Insecta: Hemiptera: Coccoidea), Kondo, T. & Watson, G. W. (2000) Collection, Preservation, Slide-mounting, … of Scale Insects, Sirisena, U. et al. (2013) Preparation of Hemiptera …, 田中 宏卓(2014) カイガラムシの標本作製法