酸性フクシン

コナジラミ

Pale puparia may be stained. Add several drops of glacial acetic acid and a few drops of acid fuchsin stain. Agitate the watch glass so the stain is uniformly mixed. Once the puparia have become a pale pink colour, decant the staining solution. Add fresh glacial acetic acid to the specimens and leave for at least 5 min to dehydrate completely. This is again pipetted off. (eppo2004)

カイガラムシ

5. Rinse and staining. Transfer to distilled water in a staining well for about 5–10 minutes; then follow one of staining methods below: Fuchsin stain: add 1–2 drops of acid fuchsin stain (see below for recipe), leave for about 30 minutes or longer until the specimens are a good bright pink colour, then continue to step 6.

Solutions 1. Acid Fuchsin Stain To make stain from the powder: add 0.35 g acid fuchsin and 25 ml glacial acetic acid to 75 ml distilled water. (Rosa C. Henderson, 2011, pp.17-18)

カイガラムシ

4. Staining
The clean specimens are stained in a mixture of acid Fuchsin stain and Essig’s aphid fluid for 12- 24 hours; this mixture has the advantage that it will not dry up, so it can be heated at 60 °C for half an hour to several hours to speed up the staining process. The staining mixture can be reused many times. Alternatively, specimens may be stained more quickly in acidified 80% alcohol (but this evaporates rapidly and there is a risk of damaging the specimens if they dry out). If specimens do not stain well (due to residual traces of KOH), a few drops of glacial acetic acid added to the dish usually darkens the stain. See Table 2 for the preparation of liquids used in the staining process.

Table 2. Common reagents used for staining scale insect cuticle

Reagent	Contents
Essig's aphid fluid	20 parts lactic acid (reagent grade 85%) + 2 parts phenol (liquefied) + 4 parts glacial (100%) acetic acid + 1 part distilled water. Heat at 56-60°C for 30-60 minutes. Label and store solution in a dark bottle.
Acid alcohol	20 parts glacial acetic acid + 80 parts 50% ethanol
Acid Fuchsin	Acid Fuchsin powder (0.5 g) + 10% HCI (25 ml) + H20 (300 ml)
Acid Fuchsin stain	3 parts acid alcohol + 1 part acid Fuchsin.

〜 (Takumasa Kondo, Gillian W. Watson, 2022)

腹吻亜目

Staining: Temporary slides were mounted in a water-soluble mountant, so staining with water soluble Acid Fuchsin was not possible. For permanent mounts, all Sternorrhyncha with membranous, colourless cuticle (except aphids and psyllids, in which pigmentation patterns are taxonomically useful) were stained in a mixture of Acid Fuchsin stain and Essig’s Aphid Fluid for 12-24 h. It is possible to stain in acidified 80% alcohol, but this evaporates quickly; Essig’s Aphid Fluid was used instead, as it does not evaporate quickly and can be heated safely. If specimens refused to take colour (due to presence of traces of KOH), a few drops Sirisena et al. 142 of glacial acetic acid were added to the dish. Staining could be accelerated by several hours by warming at 60 °C. (UGAI Sirisena, et al., 2013, p.141)

カイガラムシ

6 氷酢酸浸漬（除水，染色調整）
70％酢酸で洗浄して虫体が十分に透明になったら，染 色液を 1 ～数滴滴下した 100％酢酸を入れたシャーレに 虫を移し換え，1 時間から数時間静置して染色調整と除 水を行う。この処理では薬液を一回以上交換したほうが よい。 (田中 宏卓, 2014, p.50)

酸性フクシンによる染色。 コナジラミが染まりにくいのか、 なかなかうまく行かない。

氷酢酸、70%エタノール、70%氷酢酸(→これ氷酢酸と分ける!!)のどれでも大丈夫そうだが、 氷酢酸が酸性化されるし脱水もされるので効率的に良いと思う。

塩酸を含む酸アルコールでを使うと染まらないどころか脱色される。

前の処理が脱脂・脱ロウの場合、️排液して以下の作業に移れば良い(すすぐ必要なし)。

検体の入った容器に氷酢酸を0.5mL〜1mL程度加え、 0.01%酸性フクシン染色液を1〜数滴落とす。 60℃に加温して数時間置く。 斑に染まってくるので適当なタイミングで氷酢酸に入れ替え、 60℃に加温して半日〜1日ぐらい置く(均し)。

温度と時間は、検体の種類や状態、大きさや数等により、かなりばらつきがあると思う。

濃く染まった場合hclが無い場合は脱色するのに時間が掛かるので、 少しずつ染める方法が良いかもしれない(薄く染めて均しを行うことを繰り返す)。

実験中。

かなり薄くても染まる。

例えば、0.5mL程度の氷酢酸に対して0.01%の酸性フクシン染色液を1〜数滴で良さそう。 薄いときのメリットは溶媒はほぼ透明で検体だけが色づくので染まり具合が分かりやすいこと。 時間が掛かりそうだがどのみちムラを取るのに時間が掛かるのでたぶんトータルでは大差ない。

加温する場合はスクリューキャップのできれば小さめの容器が良い。

どれぐらいの濃さに仕上げるか。 濃いと見づらいのである程度薄い方が良い。

写真!!

実験中。

たいてい不均一に染まるので、平均化のために均し処理を行う。 氷酢酸に浸けて加温して半日〜1日置く。 酸性化を省略した場合同時に行える。 また脱水も同時に行える。

• アルカリに浸けてリセットする。酸性化をやり直す必要があるのでこれは除外するか。
• 酸アルコールに浸ける方法。なぜか短時間で脱色できる。
• 70%エタノール等に吸着剤と共に入れる方法。加温してもかなり時間が掛かる。
• 卵の殻を使う方法。

どういう理屈かまったくわからないのだけど、 酸アルコールにに浸けると急速に脱色される(常温でも数分?)。 酸アルコールの組成は10%塩酸:1容、70%エタノール:9容。

そのままだと早すぎて止めようとしたら手遅れになるのでもう少し薄める。 氷酢酸中に1滴垂らす感じ?

実験中。

70%エタノール中に吸着剤とともに入れておくと脱色されるが加温してもすごい時間が掛かる。 酸性フクシン用の吸着剤としていくつか試してみたが以下のものが使えるかもしれない。

• 卵殻膜(ゆで卵の薄皮) 小さく切って乾燥したものは保存しておける。
• シリカゲル
• 洗濯で使う色移り防止シート

実験中。

氷酢酸中に卵の殻と共に検体を入れ加温する。 卵の殻の主成分である炭酸カルシウムと酢酸が反応して中和するのかと思いきや氷酢酸だと反応しないようだ。 水を追加すると泡が出て溶ける。なぜか? 溶けてないということは変なものは生成されないんじゃないかと思うけど。 上の吸着剤と似ているがそれよりも早い気がする。

想像だが、 色素が均等に分散されるとすると外皮の厚い部分は色が濃くなり薄い部分は薄くなるはず。 そうすると外皮の厚さがかなり違うようなものを同じ容器で処理しない方が良い気がする。 例えば齢数の異なる検体を混ぜて処理しない方が良いと思う。 まぁやらないと思うけど。

コナジラミの場合、刺毛が小さくて生物顕微鏡で普通に観察するととても見づらい。 刺毛は染まりやすいと思うので最後の均し後に軽く染めることで刺毛だけ染められると良いかも? 管状孔のところも染まりやすい。 これは別のところで。

この後の透明化処理でクローブオイルに浸けるが長時間浸けると脱色される。 もし処理を中断したい場合は、染色後氷酢酸に浸けた状態で保存する。

このやりかただと染まりにくい部分も染まってしまいコントラストが低くなってしまう気がす。 といって、どうすればよいのか。

EPPO (2004) Bemisia Tabaci, Henderson, R. C. (2011) Diaspididae (Insecta: Hemiptera: Coccoidea), Kondo, T. & Watson, G. W. (2000) Collection, Preservation, Slide-mounting, … of Scale Insects, Sirisena, U. et al. (2013) Preparation of Hemiptera …, 田中 宏卓(2014) カイガラムシの標本作製法